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细胞凋亡（Apoptosis）

细胞凋亡（Apoptosis），又称程序性细胞死亡，是生物体为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主有序的死亡。

对于机体而言，凋亡有利于清除有害细胞或完成正常使命的衰老细胞，进而维持器官组织以及细胞数目的相对平衡。健康生物体内，细胞增殖和凋亡处于动态平衡状态。当凋亡受到抑制时，会引起细胞过剩性疾病，如肿瘤、自身免疫病、结肠息肉等疾病；而当凋亡过度激活造成大量细胞死亡时，会引起神经性疾病、自身免疫病、中风、心肌梗塞等疾病。

本文使用j9游会真人游戏第一品牌医学 SFLO全光谱流式细胞仪检测细胞凋亡情况，对活细胞、早期凋亡细胞及晚期凋亡细胞进行鉴定。

应用方案

仪器配置

SFLO3全光谱流式细胞仪（三激光）

激光器：405nm、488nm、635nm

实验原理

Annexin V和PI双染法是流式检测细胞凋亡的经典方法，它是基于凋亡的早期细胞膜上的磷脂酰丝氨酸（phosphotidylserine, PS）从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面这一原理来实现的。

Annexin V是一种Ca2+依赖性的磷脂结合蛋白，与PS有高度亲和力。磷脂酰丝氨酸是一种阴离子磷脂，全部处于细胞内侧。当细胞发生凋亡时，这种磷脂分布的不对称性被破坏而使PS从膜内外翻，随着凋亡细胞进程的加进，PS会越来越多地暴露在细胞表面。Annexin V结合细胞外暴露的PS，在Annexin V标记上FITC/PE或其他荧光素，同时配合膜不通透性核酸染料（PI等），即可在流式细胞仪上检测凋亡和活细胞比例。

▲图1. Annexin V/PI测定细胞凋亡原理图[1]

实验设计

1. 收集诱导凋亡的细胞，用无EDTA的PBS重悬，细胞计数；

2. 取1~10 × 10^5重悬的细胞，350 ×g离心5 min，弃上清。用无EDTA的PBS洗涤细胞一次，离心后弃上清；

3. 加入500 μL稀释的1 × Annexin V Binding Buffer重悬细胞；

4. 细胞悬液中加入5 μL的Annexin V荧光试剂和5 μL的Propidium Iodide（PI）母液（50 μg/mL）；

5. 轻柔涡旋混匀后，室温避光孵育15~20 min；

6. 立即上机检测。如不能及时检测，请于冰上避光静置并于1小时内完成检测。

实验结果

▲图2.Flowjo绘制悬浮细胞凋亡实验结果

（1）和（2）分别是未处理和加药后的两种染色方案的检测结果。悬浮细胞在喜树碱刺激后出现凋亡现象，早期凋亡和晚期凋亡分群明显，数据清晰。

▲图3. SFLO自带软件绘制贴壁细胞凋亡实验结果

Q1：左上象限（Q1）为（Annexin V-/PI+），为细胞核碎片或机械损伤细胞；

Q2：右上象限（Q2）为晚期凋亡细胞（Annexin V+/PI+）；

Q3：右下象限（Q3）为早期凋亡细胞（Annexin V+/PI-）；

Q4：左下象限（Q4）为正常（活）细胞（Annexin V-/PI-）。

从软件自带软件绘制的图3可以看出，SFLO拥有高分辨率，贴壁细胞在Raptinal刺激后凋亡，相比于未给药刺激的对照组，在前侧散中可明显分出凋亡细胞和活细胞，再通过荧光染料分析，早期凋亡和晚期凋亡细胞比例均明显增加。仪器自带软件分析绘图更加方便快捷，使用实时解混功能，在上样的同时即可同步完成数据的分析。

以上结果充分体现了SFLO仪器优异的检测灵敏性。

注意事项

1. Q1（UL）细胞碎片或机械损伤细胞占比不宜超过10%，过高说明细胞培养体系或实验操作有问题。

2. Q2（UR）晚期凋亡细胞不宜过高，因为无法区分晚凋和坏死，除非有其他实验，可以佐证这群是晚凋而不是坏死细胞。

3. 实验需要调整细胞处理时间或用药剂量，让更多的细胞位于早期凋亡细胞群。

4. 如果细胞本身存在较强自发荧光，需扣除自发荧光。

j9游会真人游戏第一品牌医学 SFLO全光谱流式细胞仪在进行双色凋亡检测时，无需考虑通道之间的干扰，实现对细胞群体的精准分型，以及对大量样品进行高通量检测，适用于多种应用场景，为不同的研究需求提供强有力的工具。

参考文献

1.  Crowley L C, Marfell B J, Scott A P, et al. Quantitationof Apoptosis and Necrosis by Annexin V Binding, Propidium Iodide Uptake, and Flow Cytometry[J]. Cold Spring Harb Protoc, 2016.